适用于CRISPR基因组编辑的一体式载体系统

       转染、富集、筛选并发表——使用我们的GeneArt® CRISPR核酸酶载体试剂盒均可完成。GeneArt® 规律成簇间隔短回文重复 (CRISPR)  核酸酶系统提供了一种简单、即用的一体式表达载体系统，包括一个Cas9核酸酶表达框和一个向导RNA (gRNA)  克隆表达框，可快速且高效地克隆编码靶点特异性CRISPR RNA (crRNA)  的DNA。您可以利用该系统，以序列特异性的方式编辑并改造您选择的基因座。采用快速且使用方便的GeneArt®  CRISPR载体鉴别相关靶点，再利用GeneArt® Precision TAL精确构建生物学相关的突变，实现高特异性和低脱靶效应。

工作原理
      基因组编辑采用人工核酸酶及内源性修复机制改变细胞DNA。CRISPR/Cas系统利用短gRNA靶向细菌Cas9内切酶至特定的基因座。鉴于gRNA的特异性，若要更改靶点只需更改编码gRNA的序列的设计即可。

基因编辑中使用的CRISPR/Cas系统包括三个组分：

Cas核酸酶Cas9 (双链DNA内切酶)、靶点互补crRNA及辅助的反式激活crRNA  (tracrRNA) (图1)。GeneArt®  CRISPR核酸酶载体的crRNA和tracrRNA共同表达为gRNA，以模拟细菌系统中的天然crRNA-tracrRNA复合物。唯一需要的是引入一条编码目标序列的双链寡核苷酸，表达复合物的crRNA部分。

图1. CRISPR/Cas9靶向的双链断裂。两条链均出现剪切，剪切位点为靶序列的3’端的NGG前间区序列邻近基序  (PAM) 序列上游的3个碱基处。

GeneArt® CRISPR核酸酶载体试剂盒

GeneArt®  CRISPR核酸酶载体试剂盒是一种报告基因载体系统，可用于哺乳动物细胞中CRISPR/Cas9基因组编辑所需的功能组件的表达。该试剂盒可提供两种不同的报告基因：采用带有橙色荧光蛋白  (OFP) 的GeneArt® CRISPR核酸酶载体，可实现表达Cas9和CRISPR RNA的细胞群体的流式细胞术分选 (荧光激活细胞分选法  (FACS))，而使用带有CD4的GeneArt® CRISPR核酸酶载体，可实现表达Cas9和CRISPR RNA的细胞的微珠富集 (图2)。

线性化的GeneArt®  CRISPR核酸酶载体提供了一种快速高效的方法，将编码理想靶点crRNA的双链寡核苷酸克隆至表达框内，实现Cas9核酸酶的序列特异性靶向。

图2. GeneArt® CRISPR核酸酶载体图谱。使用预线性化的载体  (带有5个碱基对突出末端)，轻松克隆编码靶点特异性crRNA的双链DNA寡核苷酸。图谱为带有 (A) OFP报告基因和 (B)  CD4报告基因的载体。gRNA、Cas9和报告基因均通过相同载体表达。Cas9通过核定位信号靶向细胞核 (NLS1和NLS2)。